Estudio del MIR-342-3P en la regulación de la expresión y función de EPC1 en líneas celulares de cáncer de mama

Abstract

RESUMEN

El cáncer de mama es la principal causa de muerte por cáncer en mujeres a nivel mundial y en México. Se han descrito nuevos mecanismos moleculares que participan en la regulación de la expresión génica en cáncer que incluyen a los microRNAs (miRNAs), los cuales funcionan como reguladores negativos de sus transcritos blanco y que contribuyen en el desarrollo y progresión de la enfermedad. El miR-342-3p se ha identificado como un supresor tumoral y su expresión se encuentra reprimida en diferentes tipos de cáncer. Mediante análisis bioinformáticos identificamos que el miR-342-3p puede tener como blanco directo al gen EPC1, el cual codifica para una acetilasa de histonas que regula diferentes procesos biológicos tales como regulación del ciclo celular y apoptosis; sin embargo, se desconoce su papel en el proceso metastásico en cáncer de mama. En este trabajo se determinó que la expresión del miR-342-3p es variable en las diferentes líneas celulares de cáncer de mama analizadas mediante qRT-PCR, encontrando una mayor expresión en la línea celular MCF-7 comparado con las células de tejido mamario no tumoral MCF-10A. Mediante, los ensayos funcionales encontramos que la restauración de la expresión del miR-342-3p, resultó en una disminución de la migración y una tendencia de disminución de la invasión celular en las líneas celulares de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 y Hs-578T. Por otro lado, el análisis de la expresión de EPC1 mediante ensayos de Western blot en extractos totales de proteínas, mostró mayores niveles de expresión en las células MCF-7 comparado con el resto de las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231, Hs-578T y T-47D. Adicionalmente, se analizó la expresión de EPC1 mediante RT-PCR semicuantitativa encontrando una tendencia de mayor expresión en las líneas celulares de cáncer de mama (Hs-578T, MDA-MB-231, MCF-7 y T-47D) comparado con la línea no tumoral MCF10A. Mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos se localizó a la proteína EPC1 en la periferia del núcleo, además se encontró que tiende a una mayor expresión en la línea celular MDA-MB-231 (alta capacidad metastásica) comparada con la línea celular T-47D (baja capacidad metastásica). Finalmente, mediante ensayos de luciferasa se demostró que el miR-342-3p se une directamente a la región 3´UTR del gen EPC1, por lo que se sugiere como un nuevo blanco epigenético.

ABSTRACT

Breast cancer is the main cause of death in women worldwide and in Mexico. New mechanisms such as miRNAs and their targets have been described that contribute in the regulation of the progression of the disease. Novel molecular mechanisms have been described that participate in the regulation of gene expression in cancer, including non-coding RNAs such as microRNAs (miRNAs) that function as negative regulators of their target transcripts and that contribute to the development and progression of the disease. miR-342-3p has been identified as a tumor suppressor and its expression is diminished in different types of cancer. Otherwise, we identified that protein EPC1 may be a direct target of this miRNA. EPC1 is a histone acetylase that regulates different biological processes such as regulation of the cell cycle, apoptosis and response to DNA damage; however, its role in the metastatic process in breast cancer is unknown. Our quantitative RT-PCR assays results demonstrated that the expression of miR-342-3p was variable in the different breast cancer cell lines analyzed, finding a higher expression in the MCF-7 cell line in comparison to non-tumor breast tissue cells MCF-10A. Through functional assays, we found that the restoration of miR-342-3p expression by transfection of its precursor, resulted in a significant decrease in the migration and cell invasion of the MDA-MB-231 and Hs-578T triple negative breast cancer cell lines. Moreover, the analysis of EPC1 protein by Western blot assays in total protein extracts, showed significant higher levels of expression in MCF-7 cells compared to MDA-MB-231, Hs-578T and T-47D breast cancer cell lines. Additionally, the expression of EPC1 was analyzed by semi-quantitative RT-PCR, finding higher expression in the breast cancer lines (Hs-578T, MDA-MB-231, MCF-7 and T-47D) compared to the non-tumor line MCF10A. Through immunofluorescence assays using specific antibodies, the protein EPC1 was immunolocated in the periphery of the nucleus, and a higher expression was found in the MDA-MB-231 cell line (high metastatic capacity) relative to T-47D cells (low metastatic capacity). Finally, luciferase assays showed that miR-342-3p binds directly to the 3´UTR region of the EPC1 gene, therefore it is suggested as a new epigenetic target.