Título :	Análisis del efecto de la expresión de las proteínas Eh TRF-like sobre la estabilidad del genoma Entamoeba histolytica
Autor(es):	Jordan Alejandre, Euclides
Asesor(es) :	Azuara Liceaga, Elisa Irene El telosoma es un complejo proteína-DNA que contiene a la maquinaria Shelterin, encargada de preservar la topología del cromosoma, además de contribuir en el mantenimiento y envejecimiento celular, fungiendo así como un reloj biológico que monitorea la “calidad de vida” de la célula y controla el número de replicaciones celulares. Dentro de las proteínas involucradas en este complejo, se encuentra TRF2, proteína homodimérica la cual debe su unión al telómero a su dominio de unión a DNA tipo MYB; además, mediante su dominio RBM interactúa con la proteína RAP1, evitando así la fisión de los extremos cromosómicos y preservando la estabilidad génica. E. histolytica contiene 3 ORF’s, que codifican para 3 proteínas nombradas EhTRF-like-I, - II y –III. Mediante análisis filogenéticos se determinó que EhTRF-like I y II son homólogas a HsTRF1, mientras que EhTRF-like III es homóloga a HsTRF2. En la mayoría de los organismos secuenciados los telómeros son ricos en guanina y susceptibles a la oxidación mediada por agentes genotóxicos. En E. histolytica, hasta ahora la identificación de telómeros no ha sido posible; sin embargo, análisis genómicos han identificado regiones polimórficas tipo STR, que flanquean genes codificantes para tRNA’s, ya que en otros parásitos este tipo de arreglos cumplen la función telomérica, se ha propuesto que en E. histolytica funcionan de la misma manera. En este trabajo, para determinar la unión de las proteínas EhTRF-like con diferentes fragmentos tipo STR, se empleó un ensayo DPI-ELISA indirecto. Además, para entender la función de EhTRF-like III en E. histolytica, se sobre-expresó o se inhibió a la proteína y se analizaron sus efectos fenotípicos. Para ello primeramente, los cambios de expresión fueron corroborados mediante ensayos de RT-PCR y Western Blot. Y posteriormente, los trofozoítos transfectantes se sometieron a diferentes agentes genotóxicos analizándose la viabilidad así como la formación del aducto 8-oxoG. De manera general, las proteínas EhTRF-like se unieron diferencialmente a secuencias distintas tipo STR. La sobreexpresión de EhTRF-like III condujo a una mayor viabilidad celular post-tratamiento y menor formación del aducto 8-oxoG. El silenciamiento del gen EHI_148140 generó una menor viabilidad celular post-tratamiento, similar a la observada en la especie no patógena E. dispar, además de una mayor abundancia en la formación del aducto 8-oxoG. Por lo que, en conjunto estos datos nos permiten sugerir que la proteínas EhTRF-like se unen a regiones asociadas a los arreglos de tRNA’s lo cual permite generar evidencia de que estas regiones podrían tener una papel en la función telomérica en el parásito. Además nuestros datos indican un papel relevante de la proteína EhTRF- like III en la protección del genoma en E. histolytica. Abstract The telosome is a protein-DNA complex recognized by the Shelterin machinery. This complex preserves the chromosome topology, as well as contributes to telomere maintenance and cellular ageing, acting as a biological clock that controls the number of cell replications. Among the proteins involved in this Shelterin machinery, TRF2 protein is one of the most relevant.TRF2 is a homodimeric protein that owes its binding to the telomere to its MYB- DNA-binding domain. Furthermore, through its RBM domain interacts with the RAP1 protein, thus preventing the fusion of chromosomal ends and preserving genome stability. E. histolytica contains 3 ORF's, which encode for 3 proteins dubbed EhTRF-like-I, -II, and -III. By phylogenetic analysis, it was determined that EhTRF-like I and II are homologous to HsTRF1, while EhTRF-like III is homologous to HsTRF2. In most organisms, telomeres are rich in guanine and they are susceptible to oxidation mediated by genotoxic agents. In E. histolytica, telomere identification has not been possible so far; however, genomic analysizes have identified STR-type polymorphic regions that flank genes coding for tRNAs, it has been proposed that in E. histolytica could function as chromosome ends with a telomeric function. In this work, we determined the binding of EhTRF-like proteins to one STR-type fragment, using an indirect DPI-ELISA assay. Besides, to understand the function of EhTRF-like III in E. histolytica, the protein was over-expressed or inhibited and its phenotypic effects were analyzed. To complete this task, the expression changes were corroborated by RT-PCR and Western Blot assays. And subsequently, the transfectant trophozoites were subjected to different genotoxic agents, analyzing their viability as well as the formation of the 8-oxoG adduct. In general, EhTRF-like proteins bound differentially to different the STR-like sequences. EhTRF-like III overexpression led to greater post-treatment cell viability and less formation of the 8-oxoG adduct. The silencing of the EhTRF-like III gene generated a lower post-treatment cell viability, similar to that observed in the non-pathogenic species like E. dispar, with a higher abundance in the formation of the 8-oxoG adduct. These data allow us to suggest that the EhTRF-like proteins bind to regions associated with the tRNA arrays, and provide evidence about the possible role of this regions in telomeric function in the parasite. Furthermore, our data indicate that EhTRF-like III protein is essential for protecting the genome ofE. histolytica.
Título :	Análisis del efecto de la expresión de las proteínas Eh TRF-like sobre la estabilidad del genoma Entamoeba histolytica
Fecha de publicación :	sep-2020
Palabras clave :	Licenciatura en Ciencias Genómicas Entamoeba histolytica — Genética — Investigaciones Telómero — Estructura y función Proteínas de unión al ADN — Análisis Estrés oxidativo — Aspectos genéticos Biología molecular — Entamoeba histolytica Expresión génica — Regulación Trofozoítos — Viabilidad celular Daño del ADN — Agentes genotóxicos Genómica comparativa — Homo sapiens Parasitología médica — Investigaciones — México
URI :	http://repositorioinstitucionaluacm.mx/jspui/handle/123456789/1903
Aparece en las colecciones:	Tesis Licenciatura

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